色谱作为一种分析与分离技术，已有近百年历史。近半个世纪以来，色谱技术发展迅速，无论是理论，还是各种分离模式，都趋向成熟，已作为分析化学的一个重要分支。色谱技术为医药、卫生、生化、环保等学科的发展做出了极大的贡献，同时在基因工程、生物工程及材料科学等方面也有着广阔的应用前景。作为这些学科必不可少的工具和手段，色谱技术越发显示出其重要性。最近的统计资料显示，全世界各类分析仪器中，气相色谱仪和液相色谱仪的销售额占了25%-30%。我公司目前推出了GC5400气相色谱仪和LC-3100型液相色谱仪两款仪器。以下将对色谱和色谱仪作相关介绍：

一、    色谱法的定义及分类

色谱法或色谱分析也称之为层析法（chromatograhhy），是一种物理或物理化学的分离分析方法。它利用混合物中各组分在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间作相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。可完成这种分离的仪器即色谱仪。分配系数大的组分迁移速度慢，反之迁移速度快而被分离。

色谱法从不同的角度，有不同的分类方法，通常可按聚集状态、操作方法及分离原理等进行分类。

（一）按流动相与固定相的状态分类

1、按流动相的状态分类   在色谱中流动相可以是气体、液体或超临界流体，相应分为气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和超临界流体色谱（SFC）。

2、按固定相的状态分类   固定相可以是固体或液体。因此，气相色谱法又可分为气-固色谱法（GSC）与气-液色谱法（GLC）。液相色谱又可分为液-固色谱法（LSC）和液-液色谱法（LLC）等。

（二）按操作形式分类

 按操作形式可分为柱色谱法、平面色谱法及逆流分配等类别。

（三）按色谱过程的分离机制分类

 按色谱过程的分离机制可分为吸附色谱法、分配色谱法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法、毛细管电色谱法和毛细管电泳法等。

（四）按使用领域不同分类

按使用领域对色谱仪分类可分为分析型色谱仪和制备型色谱仪。

二、    色谱法的优点

色谱法以其高超的分离能力为特点，它的分离效能远远高于其他分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。其主要优点：

（一）分离效能高  如毛细管气相色谱柱理论塔片数可达7万-12万。而毛细管电泳仪一般有几十万理论塔板数，至于凝胶毛细管电泳柱可达上千万理论塔板数的柱效。

（二）应用范围广  它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。

（三）分析速度快  一般在几分钟到几十分钟就可完成一次复杂样品的分离和分析。

（四）样品用量少  用极少的样品就可完成一次分离和测定。

（五）灵敏度高  如气相色谱可以分析几纳克的样品，火焰离子化检测器（FID）可达10^-12g/s，电子捕获检测器（ECD）达10^-13g/s，检测限为10^-9g/L和10^-12g/L。

（六）分离和测定一次完成  可以和多种波谱分析仪器联用。

（七）易于自动化  分离和分析自动完成，可以在工业流程中应用。

三、    色谱仪的特点

（一）气相色谱仪 

我公司目前生产的GC5400型气相色谱仪系微机化、高性能、低价格、设计的通用型气相色谱仪，具有高稳定、结构简洁合理、操作方便、外型美观等优点。该仪器应用范围广，适用于环境保护、大气、水源等污染的痕量检测；毒物的分析、监测、研究；生物化学；临床应用；病理和病毒研究；食品发酵；石油化工；石油加工；油品分析；地质、探矿研究；有机化学；合成研究；卫生检疫；公害检测分析和研究等。它具有如下的特点：

（1）的微机系统，的控制功能

性能的微机温度控制系统，采用了国际的控制技术，控温精度高（优于±0.05℃）、性高、抗干扰能力强；具有5个独立的控温区，控制温度达400℃；极限温度设定及过温保护功能，确保仪器的安全运行。

全中文键盘设定各种控制和使用参数（包括检测器操作参数），逻辑性强，容易操作；机内具有自诊断、断电保护、10种方法文件存储及调用、2个外部事件控制、温控定时启动和关闭，时间程序、检测器设定、量程，极性和电流设置与显示等功能，可显示各路温控设定值、实际值、保留和分析时间等。

（2）灵活的进样系统，满足各种分析要求

仪器可同时安装多达三个进样器，根据分析要求，仪器可选择进样器组合，且各单元可独立控温，进样器拆装简单。（3）单填充柱/双填充柱进样器：

可实现填充柱柱头进样方式，适用多种色谱柱；增加6通阀进行气体进样分析；在填充柱进样器中使用连接件，可简便地完成0.53宽口径毛细管柱分析。（4）提供2种毛细管柱进样系统，均适用于各种规格的毛细管柱：

a)      专用毛细管柱进样器，具有隔膜吹扫和背压阀分流调节。

b)      专用毛细管柱分流/不分流进样器，独立载气流路和尾吹气流路，具有隔膜吹扫和背压阀分流调节，进口清洗电磁阀，通过编制时间程序来实现毛细管柱分流/不分流进样。

（5）高灵敏度、高稳定性检测器

仪器可同时安装多达三个检测器，如FID、TCD、ECD检测器等。根据不同的分析应用采用不同的组合，能方便的实现检测器的串联和并联工作。

新型的FID具有更低的检测限，可方便地进行喷口和离子收集极的拆卸、清洗，精确固定的发射极安装结构确保每台仪器性能的高度一致。

高灵敏度TCD采用高阻值铼钨丝，可选配多倍电子放大电路板，灵敏度可达10000mV·mL/mg，独特的空气隔热保温结构使TCD具有更高的稳定性。

调制脉冲式ECD恒流源，灵敏度、电流选择微机化。

（6）高精度双重稳定气路

载气流路采用稳压阀及稳流阀双重稳定设计；空气和氢气流路采用稳压阀加针形阀的稳定调节模式，稳流阀和针形阀均采用数字刻度式旋钮，具有高精度、重复性好、性高且流量调节方便直观。

（7）高性能大容量柱箱

大容量柱箱可方便安装且能同时容纳毛细管柱和双填充柱；柱箱具有快速加热和快速降温即自动后开门机构，且可实现准室温控制，柱箱程序升温5阶6平台。

（8）多样免费附件，安装无忧

仪器提供初次安装使用的全套附件，如净化器、外气路管、扳手工具、注射针和各类接头，用户仅须准备气源即可。以上附件也无须另外付费。

（9）丰富的数据处理系统，让您自由选择内置式的数据采集板，使用工作站软件在电脑上进行基流监视、单柱补偿、色谱数据处理；

a 采用独立的双通道外置式数据采集盒和智能化软件组成的色谱工作站，无论是浮置信号或对地信号均可同时快速采集和精确色谱数据处理；

b RS232通讯板及软件，和工作站相连实现与主机进行双向通讯和反控，即在一台电脑上完成温度、检测器参数设置和监视，以及数据处理参数的设定；

c 独特的色谱仿真软件，在电脑上模拟寻找色谱操作条件，提供色谱仿真教学和培训、色谱知识库等。

以上是我公司目前生产的GC5400型气相色谱仪外观图，它由气路系统、进样系统、柱系统、检测系统、数据处理和控制系统组成。

进样系统：分为填充柱进样和毛细管进样、毛细管分流不分流进样。

检测系统：目前市场上应用最广的是氢火焰离子化检测器（FID）和热导检测器（TCD）、质谱检测器（MS）。

主要技术指标：

温度控制：控温范围：室温上7℃到400 ℃（增量1℃）控温对象：柱箱、检测器、热导池、进样器、辅助程升阶数：五阶程升速率：0.1℃~40℃/min (增量0.1℃)恒温时间：0~655min (增量1min)

氢火焰离子化检测器(FID) 敏感度：M≤1×10^-11g/s (C₁₆)测试结果：M≤8×10^-12g/s (C₁₆)噪  声：≤5×10^-14A漂  移：≤6×10^-13A/h线性范围：≥10⁶

热导池检测器(TCD)灵敏度：≥2500Mv/mL/mg (C₁₆)噪  声：≤20μV漂  移：≤30μV/h灵敏度：≥5000mV/mL/mg（电子放大）线性范围：≥10⁴

（二）液相色谱仪

    我公司目前生产的LC3100型智能全控液相色谱仪可以由LC-3100 高压恒流泵与LC-UV100紫外检测器直接构成等度分析系统，也可使用LC-WS100工作站同时控制数台LC-3100 高压恒流泵、LC-UV100紫外检测器及恒温柱箱等，实行多元高压梯度洗脱、波长扫描等功能。

　　LC-3100智能全控液相色谱系统操作既直观又方便。它可以在不联计算机时通过仪器本身的小键盘输入所有控制信息，所有操作都在液晶屏上显示出。也可连接计算机，使用工作站软件。该工作站与色谱仪之间没有2次模数转换，采用纯数字通讯，且读入的均为直接二通道采样数据，不经过任何处理，不存在信号畸变，这样了采样精度和后处理时不丢失数据。采样精度达18位（0.1秒/次＊2通道）。

    LC-WS100工作站分为实时采样、后处理、波长回放、图谱比较四个独立的单元。其中实时采样单元可以直接监控多达4台泵及紫外检测器。可以任意改变波长、泵的流量、氘灯开关，可以在任意时刻停泵或者切换转向阀，让组分保留在流通池里，然后自动启动波长扫描，可以得到该组分对不同波长的连续谱图。还可以连接一个转换阀，通过事件设置控制转换阀，从而达到分离回收流动相。这些都是其它工作站所不能做到的。另外，所有显示数据都已经转换成AU值，无须用户进行烦琐的折换。

由于软件是在WINDOWS系统下运行，所有功能菜单化，不需要学习，一看就会，操作简便。

图为LC-3100型液相色谱仪的外观图

仪器特点：

标配P100高压恒流泵UV100紫外检测器7725i手动进样阀Exformma Pronaos系列色谱柱Ws100工作站软件。数字化电脑智能全控液相色谱系统。往复式双柱塞并联泵：更加稳定，使用寿命更长。外型新颖，操作方便，体现人性化。各项性能指标，媲美国外流行机种。光路系统采用精密定位结构和热隔离安装技术，具有精度高，偏移小和稳定时间短的特点。零部件均采用世界的数控加工中心制造。

技术指标：

高压恒流泵基本技术指标：流量范围：0.001～9.999 mL/min流量稳定性误差：Sr≤0.3% ， RSD<0.06%流量设定值误差：Ss≤2%压力线性和度：显示压力误差≤±0.5MPa(0～42MPa)压力脉动：≤0.1 Mpa泵的密封性压力：42MPa工作压力：42MPa(0.001～9.999mL/min)外型尺寸：450mm×300mm×160mm(长×宽×高)

紫外检测器基本技术指标:波长范围：190～680nm光谱带宽：8nm波长示值误差：≤±1nm波长重复性优于0.1nm基线噪音：≤2×10^-5AU（动态）基线漂移：≤2×10^-4AU（动态）最小检测量：1×10^-8g/mL(萘的甲醇溶液)外形尺寸：450mm×300mm×160mm(长×宽×高)

四、    GC5400气相色谱仪在生物制药行业的应用及举例

（一）GC5400型气相色谱仪的应用

气相色谱作为分离技术与方法已有近50年历史。它是分析化学的重要组成部分。虽然它所能分离分析的物质只占全部有机物的20％左右，但这部分化合物却与我们的日常生活密切相关，特别是环境中的有毒有机物，这些有毒有机物中的绝大部分都是挥发性和半挥发性的。可以毫不夸张地讲，在一切需要对挥发性和半挥发性混合物进行分离分析的领域，如石油化工、有机合成、轻工食品、天然产物、卫生防疫和法医质检等，都需要气相色谱仪。在环境保护、食品安全及应对突发事故等方面，气相色谱更是扮演了重要角色。.

气相色谱仪在生物制药行业中的应用主要包括药物含量测定,杂质检查和有机溶剂的残留量、中药成份研究、药剂分析、治疗药物监测和要去代谢研究。如：测定桉油中桉油精、丁香中的丁香酚、肉桂油中的桂皮醛等等。

（二）GC5400型气相色谱仪的应用实例

1、丁香酚的含量测定（外标法）

（1）    样品

    复方南星止痛膏由生天南星、生川乌、丁香、肉桂、川芎等组成。具有散寒除湿、活血止痛之效，主要用于骨性关节炎属寒湿淤阻证。

（2）    色谱条件

色谱柱为聚乙二醇，J&WDBWAX毛细管柱（0.53nm）。柱温145℃，气化室温度220℃。气体流速氮气和氢气均为50ml/min。检测器为FID，输入高阻为10⁹，输出衰减为16.记录器量程20mv，纸速4mm/min。

（3）    校正因子的测定

   精密称取丁香酚对照品适量，加醋酸乙酯溶解并稀释至每ml含3mg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。取1ul注入气相色谱仪，连续进样3-5次，计算各锋面积，按平均锋面积计算校正因子：

                f_i=W_s/A_s

经测定，丁香酚的校正因子平均值为1.01，RSD=1.07%

（4）    供试品溶液的配置和测定

  取本品8片，除去盖衬，刮下药膏，精密称定，置500ml烧瓶中，加水约250ml，连接挥发油测定器，自测定器上端加水充满刻度部分，并溢入烧瓶为止，再加醋酸乙酯3ml，连接回流冷凝管，继续加热至沸，并保持微沸4小时，将挥发油测定器中的液体移至分液漏斗中，分取醋酸乙酯层，水层用醋酸乙酯提取一次，再用醋酸乙酯多次洗涤挥发油测定器和分液漏斗，合并上述醋酸乙酯液，转移至25ml容量瓶中，加醋酸乙酯至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取1ul注入气相色谱仪，测定，计算，即得。

    此法回收率为98.1%，RSD为0.75%。本品含丁香酚应不低于0.30%。

2、丹皮酚的含量测定（内标法）

（1）    样品

 麦味地黄丸及其他含牡丹皮的中成药

（2）    气相色谱条件

    气相色谱仪，FID检测器。色谱柱为2m玻璃柱，内填5%SE-30%Cromosorb W 80-100 目，也可以用OV-70。柱温180℃，检测器及进样器温度为220℃。载气氮气，60ml/min；氢气，50 ml/min；空气，500 ml/min，量程10²，衰减4。

（3）    标准曲线的绘制

精密称取丹皮酚对照品适量，加溶解制成每1ml含1mg的溶液，作为标准溶液。另取十八烷加丙酮制成每1ml含2mg的溶液，作内标溶液。

取标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml分别置5个10ml容量瓶中，每瓶各加内标溶液1ml，用稀释至刻度，摇匀（每1ml含丹皮酚分别为40、80、120、160、200ug）。取1ul进样，以丹皮酚峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，丹皮酚绝对量（ug）为横坐标，作图，得回归方程为Y=0.26X-0.12，r =0.9998

（4）    样品测定

取麦味地黄丸1g剪碎，精密称定，置10ml容量瓶中，加-丙酮（2：1）9ml在室温下浸泡1小时，超声波振荡提取20分钟，加内标液1ml摇匀。静置，待澄清后，取上清液1ul进样测定并计算结果。

五、    LC-3100型液相色谱仪在生物制药行业的应用及实例

（一）LC-3100型液相色谱仪在生物制药行业的应用

液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解液相色谱法性，现从两方面进行比较：

液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而液相色谱配备了高压输液设备，流速可达 103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。

    液相色谱法主要用于复杂成分混合物的分离、定性、与定量，其定性与定量方法与气相色谱相同。液相色谱法广泛用于微量有机药物及中草药成分的分离、鉴定和含量测定。近年来，对体液中原形药物及其代谢产物的分离分析，无论在灵敏度、专属性及快速性等方面都有独特的优点，已成为体内药物分析，药物研究及临床检验的重要手段。

（二）LC-3100型液相色谱仪在生物制药行业的应用实例

（1）当归芍药散的质量研究：

当归芍药散含有：当归、川芎、白芍、茯苓、白术、泽泻等；其中芍药中含有的芍药苷，当归、川芎中所含有的阿魏酸，为本方的主要化学成分，其定性和定量分析可以评价该方的内在质量。

1          材料

当归芍药散浓缩细粒

2        标准品及标准溶液

标准品：芍药苷、阿魏酸

标准溶液：精密称取10mg芍药苷置于100ml之容量瓶中加入纯水使溶解并定容，该溶液过0.45um滤膜，滤液即为标准溶液。精密称取阿魏酸对照品1mg，置于50ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，滤液即为标准品溶液。

3          样品制备及测定

精密称取当归芍药散浓缩细粒1.0g，置于100ml容量瓶中，加80ml50%甲醇，超声振荡提取30分钟，放冷，加入50%甲醇至100ml，离心10分钟，取上清液，以0.45um滤膜滤过，滤液即为样品溶液。样品溶液及标准品溶液各1ul进样，按所设置条件分离测定，以外标法计算其含量。

（2）液相色谱法测定苦参碱含量

采用液相色谱法测定苦参碱原料药的含量,用氨基硅烷键合硅胶柱(416 mm ×250mm ,5μm) ,以乙腈:无水乙醇:1 %磷酸水溶液(80 :8 :12) 为流动相,用紫外检测器于220nm 波长处检测。结果,线性范围为44164～22312mg/ L ( r =

019998) ,检测限为10ng。提示本法操作简便,分析快速,干扰小。

苦参碱(matrine) 是从苦豆子中提取的一种生物碱, 其药理作用在临床表现显著,具有抗病原微生物、抗肿瘤、抗炎症、抗过敏、平喘等作用。近年来以苦参碱为原料的各种单方或复方制剂如注射液、栓剂、软膏、气雾剂等也在治疗乙肝、妇科炎症、皮肤病及平喘等方面取得了良好效果。苦参碱国家药品标准中的含量测定方法采用酸碱滴定法,但其鉴别及有关物质的检查采用了液相色谱法进行检测。而探索用液相色谱法测定苦参碱原料药的含量,在氨基柱上对样品进行了测定,方法简便,结果,并且可以与鉴别及有关物质的检查一起进行,便于对苦参碱进行质量控制。

1 　仪器与试药

液相色谱仪(包括高压泵、手动进样器、紫外检测器、色谱工作站等) ,紫外(可见) 分光光度计。

苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所) ,苦参碱原料

乙腈、无水乙醇均为色谱纯,磷酸为分析纯,试剂用水为超纯水。

2 　方法与结果

色谱条件　色谱柱为安捷伦公司的ZORBAX NH2 柱

(416mm×250mm ,5μm) ,流动相为乙腈:无水乙醇:磷酸水溶

液(1 % ,v/ v) (80 :8 :12) ,流速110 ml/ min ,检测波长220nm ,

进样量20μl ,柱温为室温。

a  线性关系　精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱对照品约50mg ,置50ml容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。精密量取该溶液110、210、310、410、510ml ,分别置25ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件测定,以浓度(mg/ ml) 为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,求得回归方程为: Y= - 2218947 + 1084515443 X , r = 019998

结果表明:苦参碱浓度在44164～22312 mg/ L 的范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

b 精密度试验　取a）项下浓度为0.108 mg/ ml 的对照品溶液,重复进样6 次,峰面积的相对标准偏差(RSD) 为0.11 %( n = 6) 。

c 检出量　对照品溶液经用流动相稀释,当S/ N ≥3 时,苦参碱的检出浓度为0.15μg/ ml ,检出量为10ng。

d 稳定性试验　取a）项下浓度为0.108 mg/ ml 的对照品溶液,分别在第0、2、4、6、8、24 h 进样测定,峰面积的相对标准偏差(RSD) 为0.11 %( n = 6) ,表明该溶液在24h 内稳定,且进样重现性良好。

e  重复性试验　取“f”项下的供试品溶液,重复进样6次,峰面积的相对标准偏差(RSD) 为0.11 %( n = 6) 。

f  样品测定　精密称取样品适量,加流动相溶解并稀释制成浓度为0.108 mg/ ml 的供试品溶液;另精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱对照品适量,加流动相溶解并稀释制成浓度为0.108 mg/ ml 的对照品溶液,照上述色谱条件测定,按外标法以峰面积计算含量,测得3 批样品含量分别为100.11 %、99.19 %、99.19 % ,相对标准偏差(RSD) 分别为0.16 %、0.14 %、1.12 %( n = 3) ,与按酸碱滴定法测得的结果(99.16 %、99.16 %、99.14 %) 基本一致。

3、讨论

本法采用液相色谱法测定苦参碱含量,具有简便、快速、灵敏、的特点,并排除了其他生物碱的干扰,适用于对苦参碱进行含量测定。

本法的测定条件也可用于对苦参碱的鉴别和有关物质的检查,以便于生产及科研中同时对苦参碱进行鉴别、有关物质检查及含量测定的质量控制。